1. 난자 나화작업 직전에 배양기에서 수획 후 난자를 배양하고 있던 배양접시를 해부현미경으로 꺼낸다.
2. 파스퇴르 피펫을 이용하여 hyaluronidase drop에 옮긴 후, 수차례 흡입-배출하여 방사관 세포(corona cell)를 제외한 난구세포의 대부분을 제거한다.
3. 방사관 세포만 남아있는 난자-난구세포 복합체를 피펫을 이용하여 세척용 배양액에서 수차례 흡입-배출을 반복하여 hyaluronidase의 효과가 없어지도록 한 후 원래 난자가보관되어 있었던 배양접시로 옮긴다.
4. 내경이 큰 피펫을 이용하여 난자-난구세포 복합체를 조심스럽게 흡입-배출을 반복하여 남아있던 방사관세포를 제거한다. 소수가 남아있더라도 방사관 세포은 정자주입술 과정을 방해할 수 있기 때문에 어느 정도 방사관세포를 제거한 후 보다 작은 내경의 피펫을 이용하여 방사관 세포를 완전히 제거한다. 완전히 나화된 난자는 세척용 배양액 접시로 옮긴다.
5. 나화된 난자의 성숙도를 확인하고, 난자의 성숙도에 따라 난자를 구별하여, 서로 다른배양액에 두고 정자주입술 시행 시까지 배양한다. 퇴화된 난자이거나 손상되어 수정이이용할 수 없는 난자는 제거한다. 미성숙난자는 체외성숙시술 여부에 따라 체외성숙 배양액으로 옮기기도 한다. 해당 내용을 기록한다.
6. 미세조작기(micromanipulator)의 방향이동 나사가 최대 혹은 최소 위치에 있지 않는지 확인하고, 적정한 위치에 있도록 조정한다. Injector의 위치 또한 확인하고 조정한다. Heat stage의 온도가 적정한지 확인한다.
7.고정용 피펫(holding pipette)과 미세주입용 피펫(injection pipette)을 장착한다. 각 피펫의 banding 각도와 tip의 위치, 사면 각도 등을 확인하고 그에 맞추어 장착한다. 장착한 피펫은 작업 위치 근처로 내려 도립현미경으로 적절하게 장착되었는지 확인한다.
8. 시술할 환자와 배우자의 성명을 확인한 후 해당 배우자의 처리된 정자용액이 맞는지확인한다.
9. 배양접시 뚜껑에 작업용 배양액을 10ul씩 십여 개 이상 점적한다. 소적의 크기는 필요한 정자 소적의 수에 맞추어 조정한다.
10. 소적의 크기와 동일한 양의 준비된 정자용액을 얻어 준비된 첫 소적과 혼합한 후1/2을 다음 소적으로 옮겨 혼합한다. 이러한 과정을 반복하여 마지막 소적까지 혼합한후 도립현미경에서 각 소적을 관찰하여 정자주입술에 용이한 농도의 소적을 확인하고그 앞의 소적을 실제 정자주입술에 이용한다.
11. 정자주입술용 배양접시 준비 – 정자의 운동성을 감소시키기 위해 사용하는 PVP와같은 점성물질 등은 작업 전에 적정온도가 되도록 미리 꺼내 두어 평형을 이룰 수 있도록 한다. PVP와 10번에서 사용하기로 한 소적의 정자와 정해진 비율로 혼합한 후 점적하여 3~4개의 운동성 감소용 배양액 미세소적을 만든다. 그 옆에 작업용 배양액으로 난자를 두고 실제 정자주입술을 시행하는 미세소적을 만든다. 증발에 의해 삼투압이 변화하는 것을 방지하기 위하여 미네랄 오일을 덮는다.
12. 배양기에서 난자가 있는 배양접시를 꺼내어 환자와 배우자의 이름을 확인하고, 준비된 정자의 배우자명과 일치하는지 확인한다.
13. 해부현미경에서 난자의 성숙 정도를 다시 확인하고 난자의 크기보다 조금 큰 내경의파스테르 피펫으로 성숙된 난자만 준비된 정자주입술용 배양접시의 작업용 미세소적으로 옮긴다.
14. 정자주입술용 배양접시를 미세조작기가 장착된 도립현미경으로 옮긴다. 작업배율에서 현미경의 초점을 난자 투명대의 최외각 끝에 맞춘 후 고정 피펫을 작업위치로 내리고초점에 맞추어 정렬한다. 고정 피펫에 모세관 현상으로 배양액이 흡입된 것을 확인한후 약간의 배양액을 흡입시킨다. 고정 피펫은 다시 비작업 위치로 올린다.
15. 정자가 준비된 미세소적으로 현미경의 시야를 옮긴 후 작업 배율에서 미세소적의 최외각에 초점을 맞추어정자를 확인한다. 낮은 배율로 바꾼 후 미세주입용 피펫을 작업 위치로 내려 정렬하고, 다시 작업배율로 바꾼 후 정확하게 위치를 잡는다. 약간의 정자혼합액을 미세주입용 피펫으로 흡입한다. 이때 정자가 같이 흡입되지 않게 한다.
16. 정상적인 형태를 가지고 운동성을 보이는 정자를 선택하여 미세주입용 피펫으로 정자의 꼬리를 눌러 운동성을 없앤 후, 정자의 꼬리부터 미세주입용 피펫으로 흡입한다. 미세주입용 피펫 내에서 정자의 위치가 움직이지 않도록 Injector의 나사를 조정한다.
17. 현미경의 시야를 난자로 옮긴 후 현미경의 초점을 난자 투명대의 최외각 끝에 맞추고, 고정 피펫을 작업위치로 내린다. 고정 피펫과 미세주입용 피펫이 일직선 상에 위치하도록 정렬한다.
18. 고정 피펫으로 약하게 난자를 흡입하고, 미세주입용 피펫을 이용하여 난자의 제1극체가 시계 6시 혹은 12시 방향에 위치하도록 조정하고, 고정 피펫으로 강하게 흡입하여난자를 고정시킨다.
19. 미세주입용 피펫의 위치가 제1극체의 시계 3시 혹은 9시 방향이 되도록 정렬하고, 난자를 살짝 눌렀을 때 일직선으로 눌러지도록 상하 위치를 조정한다.
20. 미세주입용 피펫에서 정자혼합액을 배출하여 정자의 머리가 피펫의 끝에 위치하도록 조절한 후, 투명대에미세주입용 피펫을 근접시키고 난자를 약간 누른다. 이후 난자를 찌르면서 injector는 흡입하여 힘이 두 방향으로 동시에 작용하도록 한다.
21. 난막(oolemma)의 파열이 확인되면 정자를 미세주입용 피펫 밖으로 내보내고, 미세주입용 피펫을 난자에서 천천히 빼낸다.
22. 고정 피펫의 흡입력을 개방하여 난자를 자유롭게 한다. 고정 피펫은 비작업 위치로이동시킨다.
23. 현미경의 시야를 정자가 준비된 미세소적으로 옮긴다.
24. 작업접시를 해부현미경으로 옮겨와 정자가 주입된 난자를 배양액에 옮기고 환자의이름을 기록한 후, 배양기에서 배양한다.
25. 난자의 수만큼 위 작업(13-
24)을 반복한다.
26. 직접주입술을 종료한 시간, 시행한 난자의 수, 작업자명 등 시행한 내용을 기록한다.
27. 정해진 시간 배양 후(직접주입술을 종료한 후 16 ~ 18시간)에 배양접시를 해부현미경으로 가져와 환자의 이름을 확인한다.
28. 2개의 극체와 2개의 전핵이 확인되면 정상 수정으로 판정한다. 필요에 따라 고배율의 현미경에서 인(nucleoli)들을 관찰하기도 한다. 정상 수정란들은 적절한 수로 새로운배양접시로 옮겨 배양한다.
29. 전핵이 확인되지 않은 난자는 새로운 배양접시로 옮겨 24시간 동안 추가배양 후 전핵의 형성여부 혹은 난할 시작 등을 확인한다. 최종적으로 미수정된 것으로 확인된 난자는 실험실에서 정해진 방법에 따라 폐기한다.
30. 비정상 숫자의 전핵이 확인된 비정상 수정란은 실험실에서 정해진 방법에 따라 폐기한다. 손상된 수정란도 폐기한다.
